SMLM resolvido temporariamente (com grande mudança de PAR) permitiu a visualização da formação e migração dinâmica de clusters de HA em uma célula viva

Jul 23, 2023

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 12561 (2023) Citar este artigo

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As propriedades piscantes de uma única molécula são críticas para a microscopia de localização de molécula única (SMLM). Normalmente, as técnicas SMLM envolvem o registro de vários quadros de pontos brilhantes limitados por difração de moléculas únicas com um tempo de exposição do detector próximo ao período de intermitência. Isso define um limite na resolução temporal do SMLM para algumas dezenas de milissegundos. Percebendo que uma fração substancial de moléculas individuais emite fótons em escalas de tempo muito mais curtas do que o período médio de piscar, propomos acelerar a coleta de dados para capturar esses emissores rápidos. Aqui, apresentamos um método SMLM (shortSMLM) baseado em exposição curta, alimentado por detector sCMOS para a compreensão de eventos dinâmicos (tanto em nível de molécula única quanto em nível de conjunto). A técnica é demonstrada em um modelo de doença Influenza-A, onde células NIH3T3 (células fixas e vivas) foram transfectadas por DNA plasmídico Dendra2-HA. A análise mostra uma melhoria de 2,76 vezes na resolução temporal que vem com um sacrifício na resolução espacial, e uma mudança de resolução de partículas PAR-shift (em termos de precisão de localização) de \(\sim\) 11,82 nm em comparação com o SMLM padrão. Visualizamos a formação dinâmica de clusters de HA em células transfectadas após 24 horas de transfecção de DNA. Observa-se que uma redução na resolução espacial não altera substancialmente as características do cluster (densidade do cluster, \(\#\) moléculas/cluster, propagação do cluster, etc.) e, de fato, preserva características críticas. Além disso, a imagem de lapso de tempo revela a formação dinâmica e a migração de aglomerados de hemaglutinina (HA) em uma célula viva. Isto sugere que o uso de um detector sCMOS de alto QE sincronizado (operado em tempos de exposição curtos) é excelente para estudar a dinâmica temporal no sistema celular.

Técnicas padrão de microscopia de localização de molécula única (SMLM) (fPALM1, STORM2, PALM3, IML-SPIM4, MINFLUX5,6, dSTORM7, SOFI8, ROSE9, SMILE10,11, POSSIBLE12 e variantes13,14,15,16,17) normalmente adquirem vários milhares (\(> 10^{3}\) ) imagens de moléculas únicas para reconstruir uma única imagem super-resolvida. Isso é responsável por um tempo de aquisição considerável do que normalmente os tempos de exposição e leitura da câmera. Para acelerar a resolução temporal geral, a aquisição de dados precisa ser acelerada. Porém, há um limite na resolução temporal devido ao tempo do ciclo de fluorescência de uma molécula . Nos últimos tempos, existem poucos estudos utilizando moléculas de piscar rápido, alta intensidade de excitação, estados escuros e câmera sCMOS . Em outros estudos, a redução do tempo de aquisição usando técnicas computacionais mostrou-se promissora. Outras técnicas incluem o uso de motores de computação rápidos (FPGA-GPU e CUDA) aliados à inteligência artificial têm mostrado grande potencial no SMLM24,25,26,27. Embora essas técnicas sejam úteis, elas são propensas à fotodegradação. Aqui, discutimos a rápida aquisição de dados com tecnologia avançada sCMOS para capturar proteínas fluorescentes que piscam rapidamente (Dendra2). O comportamento de piscar do Dendra2 junto com os tempos ON/OFF é estudado detalhadamente por Avilov et al28. Espera-se que as técnicas de aquisição rápida juntamente com mecanismos de computação rápidos sejam uma combinação formidável e tenham maior probabilidade de permitir imagens de super-resolução em tempo real.

Nos últimos anos assistimos a um avanço substancial nesta direção e muitos grupos de investigação têm abordado esta questão. Uma abordagem distinta é aumentar o número de moléculas únicas ativas por quadro sem alterar a intensidade e outros parâmetros experimentais . No entanto, esta técnica tem um custo onde uma grande ativação pode resultar na sobreposição de assinaturas limitadas por difração de moléculas individuais, resultando na indistinguibilidade de moléculas individuais e subsequentemente aumentando a complexidade . Trabalho recente de Lin et al. compararam quantitativamente a qualidade da imagem para microtúbulos imunomarcados usando Alexa Fluor 647-dye19. Outro estudo de Diekmann et al. mostraram que dois fatores críticos (isto é, precisão de localização e eficiência de rotulagem) determinam a qualidade da imagem SMLM. Eles investigaram sistematicamente a consequência da velocidade na qualidade da imagem para diferentes corantes (AF647, CF680, CF660C, Dy634) em diferentes eficiências e intensidades de rotulagem . Até onde sabemos, proteínas fotossensíveis como Dendra 2 nunca foram demonstradas para microscopia de imagem rápida e microscopia de localização de lapso de tempo e, portanto, representam uma importante classe de sondas usadas em microscopia de super-resolução. Especificamente, as proteínas fotossensíveis permitem a clonagem/conjugação com proteínas de interesse, o que as torna adequadas para o estudo de processos biológicos (como a progressão da doença31,32,33) e auxiliam na compreensão do mecanismo subjacente.